NMR

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) är en spektroskopisk teknik som kan användas för att framkalla strukturella och dynamiska egenskaper hos molekyler genom att utnyttja beteendet hos vissa atomer när de placeras i mycket kraftfulla superledande magneter (180 000 till 360 000 gånger starkare än jordens magnetfält för magneter vid UConn Health). När NMR-aktiva kärnor placeras i ett kraftigt magnetfält, riktas de in med fältet och börjar bearbetas vid en frekvens som är avhängig av isotopernas gyromagnetiska förhållande och styrkan hos det pålagda magnetfältet, tillsammans med atomens kemiska och fysiska miljö. Den komponent av frekvensen som är avhängig av den kemiska och fysiska miljön kallas den kemiska förskjutningen. NMR-experiment stör inriktningen genom att tillämpa korta pulser radiofrekvens- (RF) energi för att bestämma den kemiska förskjutningen hos var och en av de NMR-aktiva atomerna i den molekyl som studeras. Genom att använda kombinationer av pulser och fördröjningar (kallas pulssekvens), kan man säkerställa ytterligare information, t.ex. vilka atomer binds till varandra, och vilka atomer är rumsligt närmare varandra. Med hjälp av många olika experiment kan man bestämma den tredimensionella strukturen hos molekyler, inkl. stora biomolekyler såsom proteiner.

NMR-undersökningar med hög upplösning är mer användbara för proteiner mindre än ca 25 kDa i vikt och lösliga till ca 0,5 mM. I vissa fall kan det vara möjligt att undersöka proteiner eller komplex av större storlek eller lägre löslighet. Membranproteiner är svåra att studera med hjälp av högupplösningsmetoder men nya tekniker utvecklas som kan vara användbara. Eftersom NMR-studier i normalfallet kräver märkning måste det finnas ett protein med stabila isotoper 15N, 13C, och ibland 2H (ett uttryckssystem som passar för tillväxt i märkta media). Proteiner måste renas (i typfallet krävs >95%), vikas och vara åtminstone marginellt stabila. Preliminär karakterisering genom cirkulär dikroism och termisk eller lösningsmedelsdenaturering rekommenderas.

Det är en svår fråga att svara på, eftersom det har samband med de frågor som ställas och hur provet beter sig. I typfallet 300 µl (med specialiserade NMR-rör) till 600 µl prov behövs. Proteinkoncentrationer för välfungerande system skall ligga över 150 µM för strukturella studier men lägre koncentrationer kan användas för andra icke-strukturella studier. Medan 150 µM är en grov uppskattning av den lägsta koncentrationen som skall användas för strukturella studier, rekommenderas det att man gör proteinkoncentrationerna så höga som möjligt, och de skall begränsas efter löslighet och proteinuppförande, inte mängden berett protein. Den tidsåtgång som läggs på längre experiment för att kompensera för låga koncentrationer, och den ökade tiden för tolknng av NMR-spektra, är med största sannolikhet längre än den tid det tar att bereda ett ytterligare prov.

När provet har renats tillräckligt och torkats är nästa moment att välja ett lämpligt lösningsmedel. Eftersom deuterium är den populäraste låskärnan löses provet normalt upp i ett deutererat lösningsmedel (d.v.s. ett lösningsmedel där en stor andel, i typfallet mer än 99%, av väteatomerna har ersatts av deuterium). Vanligen använda deutererade lösningsmedel är aceton-d6, bensen-d6 och kloroform-d, även om det finns många andra.

Faktorer som skall övervägas vid valet av lösningsmedel är:

1. Löslighet:

• Ju lösligare provet är, desto bättre är det. Detta maximerar antalet prover i den känsliga volymen som ökar känsligheten i experimentet. Hög löslighet är särskilt viktig om det finns endast små mängder av provet.

2. Interferens av lösningsmedelssignaler med provspektrat

• Lösningsmedlet i sig självt producerar NMR-signaler som döljer regioner i spektrat. Dessa 'kvarvarande lösningsmedelstoppar’ skall inte överlappa signaler från provet.

3. Temperaturberoende:

• För experiment över eller under rumstemperatur är ett lösningsmedels smält- och kokpunkter också viktiga faktorer. Dessutom varierar provets löslighet med temperaturen.

4. Viskositet:

• Ju lägre lösningsmedlets viskositet är, desto bättre är experimentets upplösning.

5. Kostnad:

• För rutin-NMR, där många prover måste mätas, är lösningsmedelskostnaderna en viktig faktor. Som tumregel ökar priset med antalet deutererade atomer.

6. Vatteninnehåll:

• Nästan alla NMR-lösningsmedel innehåller spår av vatten. Många är också hygroskopiska (de absorberar vatten från atmosfären); ju längre de lagras, desto mer vatten innehåller de. Förekomsten av en vattentopp (HDO) tjänar endast till att minska kvaliteten av NMR-spektrat. Vattennivån i lösningsmedlet kan minskas väsentligt med filtration genom ett torkmedel eller genom förvaring av lösningsmedel över molekylärsiktar.
• Valet av lösningsmedel för ett visst prov är alltid en kompromiss mellan fördelar och nackdelar. För mer detaljer om specifika lösningsmedel, se standard NMR-text.